硒与健康

硒酵母对高效氯氰菊酯致小鼠肝损伤修复作用研究

发布日间:2021-05-05   浏览次数:1672



李春霞1,陈凌云1,汤成华2,王广仪3,黄 蓓1 ( 1. 安徽大学生命科学学院,合肥 230601; 2. 安徽省华信生物药业股份有限公司,界首236500; 3. 安徽省化工研究院,合肥 230041)


摘要: 目的: 探讨硒酵母对高效氯氰菊酯致小鼠肝损伤的影响,为科学补硒、合理服用有机硒产品拮抗农残对人体的伤害奠定理论基础。方法: 检测小鼠体重、肝组织指数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶及肝组织病理切片等指标的变化。结果: 研究表明,与对照组相比,喂食硒酵母的修复组其肝脏指数差异不明显,小鼠血清中 ALT、 AST 活性分别降低了 65% 和 25% 。病理切片观察发现,对 β - CYP 染毒小鼠喂食高剂量的硒酵母后,凋亡细胞减少 25% ,其肝脏高于 75% 的细胞核恢复到正常颜色。结论: 硒酵母对修复 β - CYP 诱导的肝损伤方面有显著效果,其作用机理可能与抗氧化保护生物膜有关。


关键词: 硒酵母; 高效氯氰菊酯; 肝损伤; 修复作用

中图分类号: O627. 6 + 1 文献标识码: A 文章编号: 1005 - 5320( 2017) 05 - 0003 - 03


拟除虫菊酯类农药是继有机磷、有机氯等农药之后发展起来的一类新型杀虫剂,已被广泛应用。高效氯氰菊酯( beta – cypermethrin,β – CYP) 是目前国内最常用的一种拟除虫菊酯类农药,被我国列入替代高毒农药的理想品种,产量占据了全世界杀虫剂市场的 30% 。随着 β - CYP 使用范围的不断扩大和使用量的增加,长期接触低浓度 β - CYP引发的人类安全性问题已日益受到人们的关注。马萍等[1]研究表明,较高剂量的高效氯氰菊酯可造成小鼠肝脏的氧化损伤。毛阿敏[2]以克氏原螯虾为试验材料,安丽等[3] 以雄鼠为试验材料,都发现 β - CYP 对机体免疫功能具有明显的抑制作用。但目前有关修复 β - CYP 对生物体的损伤的研究报道还相对较少。

硒元素是在 1918 年由瑞典化学家 J. Jberzeliuz 发现的,并在 1973 年被世界卫生组织定为生物生命活动必需的微量元素,具有提高机体免疫力、抗癌、抗自由基、延缓衰老等作用。酵母是一种单细胞蛋白,是微量元素硒的良好载体。李爱芬等[4]研究显示硒酵母对小鼠具有明显的抗氧化功能。

本研究采用目前最常用的 4. 5% β - CYP 乳油对小鼠进行染毒,再喂食硒酵母,通过对小鼠肝脏指数、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的测定及对肝组织病理切片的观察,探讨硒酵母对 β - CYP 诱导的小鼠肝损伤的影响。 1 材料与方法1. 1 材料、动物与试剂SPF 级昆明小鼠 30 只,体质量重( 20 ± 2) g,雄性,购自安徽医科大学实验动物中心,实验动物生产许可证号: SCXK ( 皖) 2011 - 002。硒酵母、酵母: 华信生物药业股份有限公司; 4. 5% 高效氯氰 菊 酯: 安徽陆野农化有限责任公司; DL - 丙 氨 酸( 99. 0% ) 、DL - 门冬氨酸( 99. 0% ) : 华恒生物; α - 酮戊二酸( 99. 0% ) :上海博速医药科技有限公司; 2. 4 二硝基苯肼( 分析纯) : 南京化学试剂股份有限公司; 丙酮酸( 98. 0% ) 阿拉丁; 磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。

1. 2 仪器与设备

酶标仪: 日本岛津公司; Eppendorf centrifuge 5417R 离心机: 德国 Eppendorf 公司; EL204 电子天平: 上海特勒 - 托多利多仪器有限公司; 电热恒温水浴锅: 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司; 旋涡混悬器: 美国安胜科技有限公司。

1. 3 方 法 1. 3. 1 动物分组与模型制备

取 SPF 级体重为 40 ± 2 g 的昆明种小鼠 30 只,随机分成5 组,每组 6 只,即: 正常对照组,β - CP 染毒组,酵母组,硒酵母组,修复组。正常对照组采用蒸馏水,β - CYP 染毒组参考文献[5 ~ 7],确定染毒剂量水平 40 mg /kg,均经口灌胃给予酵母组( Yeast: 67. 5 mg /kg) 和硒酵母组( Se: 30 μg /kg, Yeast: 67. 5 mg /kg) ,修复组在给予 40 mg /kg 的 β - CYP 2 h 后,再给予硒酵母,连续灌胃 30 d,分别于实验前称小鼠体重,小鼠可以自由进食、进水。禁食不禁水 12 h 后,取血及脏器进行测定。

1. 3. 2 样本制备

摘小鼠眼球取血,血样 4℃ 静置 2 h 后,3000 r/min,4℃离心 15 min,获得上层血清,- 20℃ 保存,用于 AST、ALT 的测定; 取血后快速取出肝脏,在冰冷的 PBS( pH = 7. 5) 中漂洗,滤纸拭干,称重,计算肝脏指数; 将肝组织固定于 4% 多聚甲醛溶液,做石蜡切片观察。

1. 3. 4 生化指标的测定和脏器指数的计算

谷丙转氨酶( ALT) 的测定: 将底物缓冲液提前在 37℃水浴中预热 5 min,取 0. 1 ml 血清于 EP 管中,加入 0. 5 ml 底物缓冲液,混匀后置 37℃水浴中保温 30 min,加入 1 mmol /L 2. 4 二硝基苯肼溶液 0. 5 ml,混匀后置 37℃ 水浴中保温 20 min,再加入 0. 4 mol /L 氢氧化钠溶液 5 ml,用全波长酶标仪在 505 nm 波长下测吸光值,根据标准曲线求得 ALT 的活力单位( 以 U/L 表示) 。

谷草转氨酶( AST) 的测定: 同 ALT 比色测定法,但酶反应作用时间改为 60 min。

脏器指数按公式如下计算:肝脏指数 =[肝脏重量( g) /体重( g) ]× 100%

1. 3. 4 数据统计分析

实验数据以 x珋± s 表示,组间数据采用单因素方差分析,运用 SPSS 软件进行统计分析,P < 0. 05 表示差异显著,P < 0. 01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2. 1 硒酵母对 β - CYP 诱导的肝损伤小鼠肝脏指数的影响脏器指数是病理组织学观察中衡量脏器损伤的病理学指标,尤其病理组织学检查结果为将肝损伤一锤定音的最终诊断结果。我们分析比较了各组小鼠的肝脏指数,结果可知,与正常对照组比较,β - CYP 诱导的肝损伤小鼠的肝脏指数均显著升高( P < 0. 01) ,硒酵母组肝脏指数显著升高( P< 0. 01) ,而酵母组、修复组差异不明显。由上可知,β - CYP能够造成肝损伤,硒酵母剂量相对于正常机体是超标的,但是在修复 β - CYP 诱导的肝损伤方面作用显著。

2. 2 硒酵母对 β - CYP 诱导的肝损伤小鼠血清 AST、ALT的影响

ALT 与 AST 主要分布在肝脏的肝细胞内,肝细胞损伤时 ALT 和 AST 就会升高,其升高的程度与肝细胞受损的程度相一致。故本实验选用 ALT 和 AST 作为探讨硒酵母对 β - CYP 诱导的肝损伤保护作用的指标。

与对照组相比,β - CYP 染毒组小鼠血清中 ALT 和 AST活性分别增高了 80. 22% ( P < 0. 01) 和 20. 71% ; 硒酵母组小鼠血清中 ALT 活性显著增高了 38. 02% ( P < 0. 05) ,而 AST活性升高不明显; 而对小鼠 β - CYP 染毒后喂食硒酵母的修复组小鼠血清中 ALT 和 AST 活性分别明显降低了 65. 20% 和 25. 49% 。

2. 3 硒酵母对 β - CYP 诱导的肝损伤小鼠肝组织病理学观察

对不同处理组的石蜡切片及 HE 染色进行形态学观察,如表 1 所示,与正常对照组相比,单独喂食高剂量硒酵母组小鼠肝细胞生长周期减慢,核质比降低; 酵母组细胞分裂能力增强,细胞正常。给小鼠 β - CYP 染毒后,肝脏细胞核损伤比为 55. 9% 、凋亡小体出现率 32. 4% 及细胞质空泡化51. 6% ; 而对 β - CYP 染毒小鼠喂食高剂量的硒酵母后的修复组,其肝脏高于 75% 以上的细胞核恢复到正常颜色,不能恢复的细胞则通过包括细胞凋亡途径死亡,凋亡小体出现率降至低于 25% 。

3、讨论与结论

肝脏指数结果显示,β - CYP 染毒造成了小鼠肝脏的损伤,使其代偿性肿大,从这一侧面说明 β - CYP 引起的肝损伤和免疫功能紊乱有关,原因可能是自由基引起的细胞病理性凋亡属于免疫损伤范畴; 而灌胃硒酵母后肝脏指数有了明显的降低,表明了硒酵母对 β - CYP 诱导的小鼠肝损伤有一定程度的保护作用。

本实验中,染毒高效氯氰菊酯后,小鼠血清中的 ALT 和 AST 的活性升高,而喂食硒酵母后,小鼠血清中的 ALT 和 AST 活性明显降低。且肝脏组织学观察结果表明,小鼠 β - CYP 染毒后肝细胞出现了大量的空泡化及凋亡小体,而喂食硒酵母后细胞核损伤比与凋亡小体出现率均降低。另外,我们还发现使用的 30 μg /kg 高硒含量对小鼠肝损伤的恢复比较好,但对正常肝脏就有轻微的抑制其生长。有研究表明,高效氯氰菊酯是一种疏水性化合物,能聚集在细胞膜,改变膜的流动性,破坏膜的结构[6]。Grajeda - Cota P 等[8] 也发现 β - CYP 进入机体后可以裂解为不稳定的氰腈,进而分解为氰化物和醛,而氰化物和醛也可产生氧自由基。故实验中小鼠染毒 β - CYP 后,β - CYP 产生的氧自由基破坏了肝细胞的细胞膜、线粒体膜和核膜,肝细胞中的 ALT 和 AST 外 流,使得小鼠血清中的 ALT 和 AST 活性升高,线粒体基质中的物质外流,诱导凋亡因子( AIF) 、致死性蛋白及各种酶类释放进入细胞质基质,破坏细胞结构,肝细胞出现空泡化和凋亡小体,细胞核中染色质降解,核染色变浅。研究显示硒作为含硒的谷胱甘肽过氧化物酶( GSH - Px) 的活性中心,调节着生物体抗氧化防御体系的主要组成部分[9]。研究还发现,硒可抑制鼠脂质过氧化物产生和血清转氨酶的活力,并可抑制脂质过氧化激发的肝细胞胶原形成。给小鼠喂食硒酵母后,提高了谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性,清除β - CYP 产生的氧自由基,保护了肝细胞的膜结构,对 β - CYP 诱导的小鼠肝损伤起到保护作用。

综上所述,硒酵母对 β - CYP 诱导的小鼠肝损伤具有一定的预防保护作用,该作用机理可能与其抗氧化保护生物膜

有关。


参考文献:

[1] 马 萍,秦龙娟,张亚然,等. 高效氯氰菊酯对小鼠肝细胞的氧化损伤[J]. 环境科学学报,2012,32( 3) : 757 - 761.


[2] 毛阿敏. 高效氯氰菊酯对克氏原螯虾免疫毒性的研究[D]. 山西大学,2013.

[3] 安 丽,蔡 原,吕相征,等. 高效氯氰菊酯对雄性小鼠免疫功能的影响[J]. 中国公共卫生,2002,18( 4) : 444 - 445.

[4] 李爱芬,张惟杰. 硒酵母生理功能研究( I) —对小鼠全血 GSH - Px,SOD 及 LPO 值得影响[J]. 烟台大学学报

( 自然科学与工程版) ,1997,10( 1) : 30 - 32.

[5] 佟俊旺,王 颖. 氯氰菊酯和溴氰菊酯对雄性小鼠淋巴细胞 DNA 的损伤[J]. 环境与健康杂志,2008,25( 8) :

705 - 707.

[6] 王献忠,吴建云,孙 燕,等. 高效氯氰菊酯通过 E R K1 /2 影响小鼠睾丸睾酮合成[J]. 畜 牧 兽 医 学 报, 2007,38( 9) : 920 - 925.

[7] 赵 越,安 丽,刘儒曦,等. 乙体氯氰菊酯致小鼠脑组织 Glu - G1n 环路紊乱的实验研究[J]. 中国工业医学

杂志,2007,20( 1) : 44 - 45.

[8] Grajeda - Cota P,Ramirez - Mares M V,Gonzalez de Me- jia E. Vitamin C protects against in vitro cytotoxicity of cypermethrin in rat hepatocytes[J]. Toxicol in Vitro,2004, 18( 1) : 13 - 19. [9] ARTEEL G E,SIES H. The biochemistry of selenium and the glutathione system [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology,2001,10( 4) :

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